CNW 黃曲霉毒素 B1 免疫親和柱 SBEQ-CC15001 在食品與飼料檢測中的凈化應(yīng)用方案
上海儀器網(wǎng) / 2025-09-30
一、方案背景與目的?
黃曲霉毒素 B1（AFB1）作為強毒性真菌毒素，廣泛污染花生、玉米、飼料等基質(zhì)，其檢測需精準規(guī)避基質(zhì)干擾。CNW SBEQ-CC15001 免疫親和柱采用AFB1 特異性抗體包被樹脂，柱體積 3mL，可通過抗原 - 抗體特異性結(jié)合實現(xiàn) AFB1 的高效富集與凈化。本方案依據(jù) GB 5009.22-2016 與 NY/T 2549-2014 標準，針對谷物、堅果、植物油脂及飼料等多基質(zhì)樣品，建立標準化凈化流程，為后續(xù) HPLC、熒光檢測等提供低干擾樣品，確保檢測結(jié)果符合法規(guī)限值要求（如食品中 AFB1 限量≤5μg/kg）。?
二、實驗原理?
SBEQ-CC15001 柱內(nèi)免疫親和樹脂通過共價鍵固定 AFB1 單克隆抗體，當樣品提取液過柱時，AFB1 與抗體特異性結(jié)合，而糖類、脂肪、色素等雜質(zhì)隨流出液棄去。經(jīng)淋洗去除殘留雜質(zhì)后，用甲醇洗脫使抗體變性，AFB1 隨洗脫液收集，實現(xiàn) "特異性吸附 - 雜質(zhì)去除 - 靶向洗脫" 的凈化過程。該原理使柱體對 AFB1 的交叉反應(yīng)率≤10%，柱容量≥30ng，滿足高靈敏度檢測需求。?
三、實驗材料與設(shè)備?
1. 實驗材料?
- 樣品：花生（粉碎過 20 目篩）、玉米粉、大豆油、配合飼料；?
- 試劑：甲醇（色譜純，用于洗脫）、乙腈（分析純，用于提取）、0.1% 吐溫 - 20 的 PBS 溶液（淋洗用）、超純水（符合 GB/T 6682 二級標準）、AFB1 標準品（1000ng/mL）；?
2. 實驗設(shè)備?
- 高速離心機（轉(zhuǎn)速≥8000r/min）、渦旋振蕩器、氮吹儀（37℃）、高效液相色譜儀（配熒光檢測器）、電子天平（精度 0.1mg）。?
四、實驗操作流程?
1. 樣品前處理（分基質(zhì)優(yōu)化）?
（1）谷物 / 堅果類（以花生為例）?
- 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50mL 離心管，加 25mL 乙腈 - 水（7:3，v/v），渦旋 3min，8000r/min 離心 10min；?
- 取 10mL 上清液，加 20mL 超純水稀釋，經(jīng)玻璃纖維濾膜過濾，收集濾液備用。?
（2）植物油脂類（以大豆油為例）?
- 稱取 2.0g 樣品于 50mL 離心管，加 10mL 正己烷渦旋溶解，再加 10mL 甲醇 - 水（7:3，v/v）萃取 2min；?
- 8000r/min 離心 5min，取下層甲醇水溶液，加 10mL 超純水稀釋，過濾后備用。?
（3）飼料類?
- 稱取 10.0g 飼料樣品于 50mL 離心管，加 40mL 70% 甲醇溶液，渦旋 5min，8000r/min 離心 15min；?
- 取 15mL 上清液，加 30mL 超純水稀釋，過濾后備用。?
2. 免疫親和柱凈化（核心步驟）?
- 柱活化：取出 SBEQ-CC15001 柱，恢復(fù)至室溫（22-25℃），移除上下端塞子，棄去保存液至液面高于凝膠 3-5mm，連接 10mL 注射器；?
- 上樣：將上述濾液注入注射器，調(diào)節(jié)流速至 1-2 滴 / 秒，使液體緩慢過柱，棄去流出液（谷物 / 堅果樣品上樣 15mL，油脂樣品上樣 10mL）；?
- 淋洗：谷物 / 油脂樣品用 10mL 超純水淋洗 2 次，飼料樣品先用 10mL 0.1% 吐溫 - 20 PBS 溶液沖洗，再用 10mL 超純水淋洗 2 次，每次均棄去流出液；?
- 吹干：通過真空裝置向柱內(nèi)壓入空氣，直至柱內(nèi)凝膠完全吹干；?
- 洗脫：加 1mL 甲醇至柱內(nèi)，控制流速 2-3 秒 / 滴，收集全部洗脫液至離心管，37℃氮吹至近干，用甲醇復(fù)溶至 1mL，待檢測。?
3. 后續(xù)檢測銜接?
將復(fù)溶后的樣品經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾，注入 HPLC 系統(tǒng)：色譜柱為 C18 柱（250mm×4.6mm），流動相為甲醇 - 水（60:40，v/v），流速 1.0mL/min，熒光檢測器激發(fā)波長 365nm，發(fā)射波長 435nm，外標法定量。?
五、關(guān)鍵注意事項?
- 安全防護：AFB1 毒性極強，操作需戴乳膠手套、護目鏡，在通風櫥內(nèi)進行；接觸過毒素的容器需用 10% 次氯酸鈉溶液浸泡 12h 以上；?
- 流速控制：上樣與洗脫流速需嚴格遵循 1-3 秒 / 滴，過快會導(dǎo)致抗體結(jié)合不充分或洗脫不完全，使回收率下降；?
- 柱體維護：柱體需在 2-8℃保存，使用前恢復(fù)室溫，避免溫度驟變導(dǎo)致抗體失活；單次使用后按危廢處理，不可重復(fù)使用；?
- 基質(zhì)適配：醬油、食醋等液體樣品需額外用 0.1% 吐溫 - 20 PBS 溶液預(yù)處理，減少基質(zhì)黏附對凈化的影響。?
六、凈化效果驗證?
- 回收率測試：向空白花生樣品中添加 1.0μg/kg AFB1 標準品，經(jīng)本方案處理后，回收率為 85%-95%，符合國標 GB 5009.22-2016 要求（70%-110%）；?
- 純度驗證：對比凈化前后 HPLC 色譜圖，凈化前樣品基質(zhì)峰（保留時間 2-4min）顯著，AFB1 峰（保留時間 8.2min）被掩蓋；凈化后基質(zhì)峰消失，AFB1 峰形對稱，基線平穩(wěn)；?
- 靈敏度驗證：對飼料樣品檢測的檢出限為 0.3μg/kg，滿足 NY/T 2549-2014 標準要求，可精準檢測法規(guī)限量附近的樣品。?
